高效液相色譜(HPLC)是20世紀60年代后期發(fā)展起來的分離分析技術(shù)，是現(xiàn)代分離測定的重要手段。問世以來，因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析高沸點但不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性 物質(zhì)的特點而被廣泛應(yīng)用于生物化學、藥物及臨床分析。
高效液相色譜是用高壓輸液泵將具有不同極性的 單一溶劑或不同比例的混合溶劑，緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進樣閥注入待測樣品，由流動相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄。
色譜柱是高效液相色譜的心臟，在高效液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透粉性，延長 柱子的使用壽命非常重要。因此對高效液相色譜柱的維護是關(guān)鍵。
1色譜柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70㎏/㎝2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。
為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或欽合金，孔徑0.2-20 μm(5-10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同:
(I)常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2-5mm(常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm )，柱長10-30cm ;
(2)窄徑柱，又稱細管徑柱、半微柱，內(nèi)徑1 -2mm ,柱長10-20cm;
(3)毛細管柱(又稱微柱)，內(nèi)徑0.2-0.5mm;
(4)半制備柱，內(nèi)徑>5mm;
(5)實驗室制備柱，內(nèi)徑20-40rnm，柱長10-30cm;
(6)生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。
2色譜柱的使用和維護
在日常分離分析工作中，色譜柱的正確使用和維護十分重要，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
(1)柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。
(2)如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
(4)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?
(5)如使用柱溫控制裝置時，應(yīng)注意在通人流動相后才能升溫。
(6)一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。
(7)選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
(8)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
(9)經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。
(10)保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。
(11)色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗;另一種可能是大分子進人柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
(12)在完成分離分析工作之后，不應(yīng)立即停機，需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
