緩沖液可以使分析物保持在所需的pH值處。
如果您使用緩沖液是為了保持pH值，則僅需要很少的緩沖范圍。
在分析工作中，許多樣品都在 g/mL到ng/mL的范圍內(nèi)。因此，對于<100 L的注射，色譜柱上的質(zhì)量將不超過幾百納克。
即使在緩沖液的pKa為1個pH單位的情況下，也僅需要很少的緩沖液來為樣品提供所需的緩沖。
緩沖液也必須緩沖色譜柱，使其保持恒定的pH值。
由于大量的緩沖流動相通過色譜柱，所以固定相不斷暴露于緩沖液中。
較新的高純度硅膠色譜柱含有較少的酸性硅醇基團，因此與較舊的低純度硅膠色譜柱相比，所需的緩沖液就較少。
圖4的色譜圖顯示了該色譜柱的這一特性。（在這個應(yīng)用中，三氟乙酸可以保持較低的pH值，也可以作為離子對試劑，所以這兩種作用并不是相互孤立的）。
注意，在色譜圖的左列中，當(dāng)在流動相中添加0.1％的TFA時，可以比較所有三個柱的峰形。
如圖4右側(cè)的色譜圖所示，當(dāng)TFA的濃度下降10倍至0.01％時，硅膠純度與峰形的相關(guān)性十分明顯。而在0.1％TFA的情況下，高純度硅膠柱的峰形略有降低，但中低純度硅膠柱的峰形發(fā)生了急劇變化。
兩組色譜圖之間僅有TFA的濃度發(fā)生了變化。可以看出，TFA能夠?qū)ιV柱起到緩沖作用（至少部分有效），可將導(dǎo)致峰拖尾的強相互作用最小化。
當(dāng)緩沖不足時，所有色譜柱的峰形都會變差。雖然大多數(shù)的新方法是基于高純度B型硅膠開發(fā)的，但硅醇基的酸度在不同制造商之間有較大的差異。
但硅醇基的酸度在不同制造商之間有較大的差異。安全起見，應(yīng)使用多于所需最小量的緩沖量。因此，在約0.1％v / v的范圍內(nèi)，我們推薦最終溶液中，酸性添加劑在約0.1％v / v的范圍內(nèi)，或者至少含有5-10mM的緩沖液。
最后，也是最重要的，注射緩沖液是為了緩沖樣品，使其快速達到流動相的pH值。
很明顯，在與流動相具有相同pH值的條件下，如果對溶劑注入少量樣品，那么流動相緩沖液會更容易起作用；相反，如果與流動相的pH值相差過大，并對溶劑注入大量樣品，將不會起到明顯作用。通過在注射前調(diào)節(jié)樣品的pH值，流動相則無需高濃度緩沖液。
圖4 三氟乙酸的峰形效果
色譜柱：250x4.6mm, 5 m, C18 300?。
條件：A：0.1%或0.01%的
TFA（溶于水中）；B: 0.1%或0.01%的TFA（溶于ACN）；30分鐘內(nèi)的5-70% B；1.00mL/min, 280nm。
成分（保留順序）：核糖核酸酶A、細胞色素C、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、脫輔基肌紅蛋白。
